BÀI 6. THỰC HÀNH TÁCH CHIẾT DNA

I. YÊU CẦU CẦN ĐẠT

Thực hành tách chiết được DNA từ các mẫu vật sống.

II. CHUẨN BỊ

1. Dụng cụ, thiết bị

• Chày, cối sứ hoặc máy xay thịt, máy nghiền mẫu vật sống.

• Ống nghiệm thuỷ tinh, giá đỡ ống nghiệm, giấy lọc và phễu lọc.

• Tăm tre dài hoặc que tre tròn hay que thuỷ tinh.

2. Nguyên liệu, hóa chất

• Gan gà hoặc mô động vật, thực vật tươi sống bất kì. Tuỳ điều kiện thực tế để lựa chọn mẫu vật cho phù hợp.

• Dứa tươi: 1/4 quả.

• Nước rửa chén bát hoặc dung dịch tẩy rửa: 500 mL.

• Cồn ethanol lạnh (70 – 95%): 500 mL.

III. NGUYÊN LÝ VÀ CÁCH TIẾN HÀNH

Quy trình dưới đây mô tả các bước tách chiết DNA với mẫu vật là gan gà.

• Bước 1: Nghiền khoảng 5 g gan gà, cho thêm khoảng 150 mL nước lạnh vào, khuấy đều. Lấy 1/4 quả dứa đã gọt vỏ, ép lấy nước đổ vào một ống nghiệm.

• Bước 2: Lọc dung dịch qua phễu lọc, chỉ lấy dịch nước trong.

• Bước 3: Cho dịch lọc vào trong một ống nghiệm khác cùng với 30 mL nước rửa bát pha loãng, khuấy đều, sau đó để yên khoảng 5 – 10 phút.

• Bước 4: Rót hỗn hợp từ bước 3 sang ống nghiệm mới với thể tích dịch khoảng 1/3 đến 1/2 ống nghiệm; bổ sung 5 mL nước dứa tươi vào ống nghiệm và khuấy nhẹ rồi để yên trong khoảng 10 phút.

• Bước 5: Ống nghiệm lấy từ bước 4 được đổ thêm cồn ethanol. Sau ít phút, DNA được kết tủa sẽ nổi lên ở lớp cần phía trên ống nghiệm. Dùng tăm tre hoặc đũa thuỷ tinh quấn lấy DNA và đưa ra khỏi ống nghiệm. 

IV. THU HOẠCH

BÁO CÁO THỰC HÀNH

1. Mục đích

Thực hành tách chiết được DNA từ các mẫu vật sống.

2. Kết quả và giải thích

* Kết quả là thu được kết tủa DNA màu trắng.

* Giải thích:

- Để tách chiết DNA ra khỏi tế bào, cần phải phá vỡ màng tế bào và màng nhân bằng dung dịch tẩy rửa để giải phóng DNA từ nhân tế bào vào dung dịch chiết xuất.

- Trong tế bào, DNA kết hợp với nhiều protein, cần loại bỏ các protein bằng enzyme phân giải protein là protease (có trong nước ép dứa tươi), để dung dịch chỉ còn DNA và RNA.

- Để tách DNA ra khỏi dung dịch chiết xuất, cần kết tủa DNA bằng ethanol.

- Do ethanol nhẹ hơn nước, nên ethanol sẽ nổi lên trên cùng với DNA kết tủa.

3. Trả lời câu hỏi

Câu 1: Tại sao phải sử dụng dung dịch nước rửa chén bát hay dung dịch tẩy rửa?

Đáp án chuẩn:

Để tách chiết DNA ra khỏi tế bào, cần phải phá vỡ màng tế bào và màng nhân bằng dung dịch tẩy rửa để giải phóng DNA từ nhân tế bào vào dung dịch chiết xuất.

Câu 2: Tại sao cần sử dụng nước dứa? Có thể thay nước dứa bằng dung dịch gì?

Đáp án chuẩn:

- Trong tế bào, DNA kết hợp với nhiều protein như histone và các protein điều hoà và phiên mã. Để loại bỏ các protein này, sử dụng enzyme protease (có trong nước ép dứa tươi) để phân cắt chuỗi polypeptide thành các amino acid đơn phân hoặc đoạn peptide nhỏ, khiến dung dịch chỉ còn các đại phân tử DNA và RNA.

- Có thể thay thế nước dứa bằng các dung dịch khác như EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), PBS (phosphate-buffered saline) hoặc Tris - HCl (tris(hydroxymethyl) aminomethane - hydrochloride), nhưng cần lựa chọn dựa trên mục đích cụ thể của thí nghiệm do mỗi dung dịch có ảnh hưởng khác nhau đối với quá trình tách chiết DNA.

Câu 3: Tại sao cần sử dụng cồn ethanol?

Đáp án chuẩn:

- Khi ethanol được thêm vào dung dịch chiết chứa DNA, do ethanol có ái lực với nước mạnh hơn so với DNA, các phân tử DNA có xu hướng kết tụ lại gần nhau và kết tụ thành vật chất có màu trắng dục.

- Ethanol nhẹ hơn nước, nên khi được thêm vào trên cùng của dung dịch chiết, nó tạo thành lớp trong suốt trên cùng của dung dịch trong ống nghiệm. DNA trong dung dịch sẽ đi lên qua lớp ethanol và kết tụ dưới dạng vật chất có màu trắng đục. 

Câu 4: Cần phải cải tiến, khắc phục điều gì để thu được kết quả tốt hơn?

Đáp án chuẩn:

- Đeo bao tay và mặc đồ bảo hộ cẩn thận.

- Chọn lựa mẫu vật tốt, lưu trữ và xử lý đúng cách trước khi bắt đầu quá trình tách chiết.

- Khi nghiền mẫu cần phải nghiền kỹ.

- Lựa chọn dung dịch tách chiết phù hợp với loại mẫu và ứng dụng cụ thể.

- Sau khi tách chiết DNA, thực hiện các bước làm sạch để loại bỏ tạp chất (protein, RNA).

- Kiểm tra và đánh giá hiệu suất tách chiết.